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WB實(shí)驗(yàn)中的磷酸酶抑制劑

一、WB實(shí)驗(yàn)中的磷酸酶抑制劑的作用細(xì)胞或組織裂解時(shí)會(huì)釋放出大量內(nèi)源性蛋白磷酸酶，以各種方式催化磷酸化蛋白的去磷酸化，從而影響后續(xù)的蛋白檢測(cè)。因此在提取物中適量添加外源性磷酸酶抑制劑，有利于在之后的Westernblotting、免疫共沉淀檢測(cè)磷酸化蛋白質(zhì)和蛋白激酶活性測(cè)定等實(shí)驗(yàn)過程中抑制磷酸化蛋白的去磷酸化，維持蛋白質(zhì)的磷酸化狀態(tài)。二、WB實(shí)驗(yàn)中的磷酸酶抑制劑的作用原理在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中，靶蛋白會(huì)被可將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到特定位點(diǎn)的蛋白激酶磷酸化。這些磷酸基團(tuán)在細(xì)胞裂解時(shí)會(huì)被內(nèi)源性蛋...

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WB實(shí)驗(yàn)中的蛋白酶抑制劑

一、WB實(shí)驗(yàn)中的蛋白酶抑制劑作用WB實(shí)驗(yàn)中的蛋白酶抑制劑主要是在蛋白質(zhì)提取過程中，防止蛋白質(zhì)水解，從而保持蛋白質(zhì)的完整性。在蛋白質(zhì)純化、提取過程中常受到其本身存在的水解酶的影響。在提取蛋白質(zhì)的過程中細(xì)胞破碎釋放出蛋白酶，這些酶在與欲提取的蛋白質(zhì)接觸時(shí)，一旦條件適宜，就會(huì)發(fā)生反應(yīng)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)分解。二、WB實(shí)驗(yàn)中的蛋白酶抑制劑的作用原理蛋白酶抑制劑（proteaseinhibitor）從廣義上指與蛋白酶分子活性中心上的一些基團(tuán)結(jié)合，使蛋白酶活力下降，甚至消失，但不使酶蛋白變性的物...

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蛋白Marker的分類

在WesternBlot實(shí)驗(yàn)中，蛋白Marker的作用就像是參照標(biāo)尺，用于目標(biāo)蛋白分子量大小的確定、蛋白分離成功與否的判斷等。因此，選擇合適的蛋白Marker，對(duì)實(shí)驗(yàn)來說至關(guān)重要，那你知道蛋白Marker的分類是如何劃分的嗎？讓我們一起來看看吧！一、非預(yù)染蛋白Marker非預(yù)染蛋白Marker是幾種已知分子量并純化好的蛋白質(zhì)預(yù)混液，方便不同大小的蛋白比較。其條帶在結(jié)合染料時(shí)，分子量不會(huì)改變，可準(zhǔn)確評(píng)估SDS-PAGE的蛋白樣品分子量。非預(yù)染蛋白Marker在電泳過程中看不到，...

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細(xì)胞復(fù)蘇的小Tips

一、細(xì)胞復(fù)蘇的原理細(xì)胞復(fù)蘇的原理是基于將細(xì)胞從液氮或-80℃冰箱中快速取出并使其恢復(fù)活力的技術(shù)。遵循“快融”原則，短時(shí)間內(nèi)融化胞外結(jié)晶，避免緩慢融化導(dǎo)致水分滲入胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶損傷細(xì)胞，融化越快，細(xì)胞損傷越小。二、細(xì)胞復(fù)蘇的小Tips1.為防止凍存管在水浴鍋中升溫時(shí)突然爆炸，可以在放入水浴鍋前先在生物安全柜中把蓋子擰松一下然后再擰上。2.從液氮罐里拿出細(xì)胞不必急于放入水浴鍋中，因?yàn)榧?xì)胞從液氮的-196℃上升到-80℃這個(gè)過程對(duì)細(xì)胞是沒有損害的，我們有足夠的時(shí)間處理。但是，一...

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免疫組化（IHC）SP法，原來如此簡單！

免疫組化，是應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，即抗原與抗體特異性結(jié)合的原理，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑(熒光素、酶、金屬離子、同位素)顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原(多肽和蛋白質(zhì))，對(duì)其進(jìn)行定位、定性及相對(duì)定量的研究，稱為免疫組織化學(xué)技術(shù)或免疫細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。一、SP法步驟1.SP三步法脫蠟→梯度水化→滅活內(nèi)源性過氧化物酶→抗原修復(fù)→封閉→一抗孵育→二抗孵育→SP反應(yīng)→DAB顯色→蘇木素復(fù)染→常規(guī)脫水→透明→封片2、免疫組化的關(guān)鍵環(huán)節(jié)①脫蠟和水化②抗原修復(fù)③滅活內(nèi)源性過氧化物酶和...

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